原生质体融合的诱导融合法是怎样做的？

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诱导融合的方法大体可以分为物理的和化学的两类。前者是利用显微操作、灌流吸管、离心或振动等机械以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，化学融合法是用不同的试剂作诱导剂，促使原生质体融合，形成异核体（heterokaryons）。

目前常用的较有效的是高pH—高钙法、NaNOsubscript3subscript和聚二乙醇法。

图3-1：原生质体融合方法

植物体细胞杂交是在原生质体培养技术的基础上，借用动物细胞融合方法发展起来的一门新型生物技术。植物体细胞杂交的过程包括原生质体的制备，原生质体融合的诱导，杂种细胞的筛选和培养，以及杂种植株的再生与鉴定等环节。下面以烟草和大豆的体细胞杂交为例，简要介绍植物体细胞杂交的过程。

原生质体制备选取烟草植株上的幼嫩叶片和培养好的大豆细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆的无色，在显微镜下很容易将二者区别开来。

原生质体融合取等量的烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。

杂种细胞的筛选和培养烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，使原生质体再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法。以机械方法为例，根据两种亲本细胞在形态、色泽上的差异，将细胞分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约放1～3个细胞。在显微镜下找出杂种细胞，并且标定位置。等杂种细胞分裂成细胞团时，转移到培养皿中，培养成愈伤组织。

杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生是指从愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，因此谈不上杂种植株的再生和鉴定。对于能够再生出杂种植株的，如烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株的鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等

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